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本试剂盒适用于从各种原代或传代细胞和各种实体组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等动物组织中分步提取膜蛋白/胞浆蛋白/核蛋白。提取过程简单方便，可在1小时内完成。

本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解细胞膜组份，包括细胞质膜、核膜和各种细胞器膜。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

• 本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。
  
• 本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。
  
• 本试剂盒提取的蛋白可用于WB、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。
  
• 本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用我公司其他货号试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理（相关产品HR0389）。

• 使用方便，不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 将蛋白提取的时间缩短至1小时。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

• 提取液制备：
  每400μL冷的蛋白提取液A/B/D中加入分别加入2μL蛋白酶抑制剂混合物和2μL磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  注：
  ● 据需处理样品数准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可一次全部加入提取液。
  ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未用完，再次使用前需再次加入蛋白酶抑制剂。
  ● 蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶、磷酸酶活性等下游实验时，注意根据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。
  
• 取5～10×10⁶个细胞，在4℃，800×g条件下离心5～10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干。
  注：
  ● 贴壁培养细胞用细胞刮刀收集细胞或胰酶消化下来均可。
  ● 组织样本50～100mg用手术剪刀尽可能剪碎，加冷PBS，用组织匀浆器/匀浆机匀浆至无明显肉眼可见固体（或用液氮稍微研磨），冰上静置5分钟，小心将匀浆吸入另一预冷的干净离心管。在4℃，500×g条件下离心5分钟，弃上清，收集沉淀。
  
• 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
  
• 每5×106个细胞中加入400μL冷的蛋白提取液A，混匀后，在4℃条件下用试剂盒所配针筒反复吸吹细胞，使细胞完全破裂。
  注：
  ● 一般反复抽吸至轻微起泡即可。
  ● 可以吸取少量液体进行镜检。
  
• 在4℃，1000×g条件下离心5分钟。
  
• 将上清（Ⅰ）吸入另一干净离心管，在沉淀中加入100～200μL冷的提取液B，高速涡旋振荡15秒，充分混匀。
  
• 将混匀的提取液B置4℃低速振荡30～40分钟。
  注：
  ● 使用较低转速保持提取液稍微晃动即可。
  ● 没有振荡条件可以不振荡，置2～8℃静置，稍微延迟处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
  
• 在4℃，12000×g条件下离心10分钟。将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。
  
• 在步骤6中所得到的上清（Ⅰ）中加入8μL提取液C，充分混匀。
  注：
  ● 添加试剂C时注意有效的加入，由于试剂C比较粘稠，可能会吸附在吸头，没有添加进去，气温较低时可以把吸头和试剂C在37℃预热一下。
  ● 添加时不要将吸头伸入到冷的试剂A中，会导致试剂C凝固而出不来，在接近液面的地方沿着离心管壁加入，注意观察是否有效加入。
  ● 加入后充分混匀。
  
• 在2～8℃振荡20～30分钟。
  注：
  ● 此步骤必须在2～8℃条件。
  ● 使用较低转速保持提取液稍微晃动即可。
  ● 没有振荡条件可以不振荡，置2～8℃静置，稍微延迟处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
  
• 在37℃水浴10分钟。
  
• 在37℃下1000×g离心3分钟，此时溶液分为两层，上层是胞浆蛋白部分，下层部分（Ⅱ）是膜蛋白约为40～50μL。
  注：
  ● 必需保证在37℃左右下离心，至少确保30℃以上。
  ● 无可控温离心机时，也可不离心，延长37℃水浴时间至溶液变澄清，分层明显即可。
  
• 将上层小心吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白。
  
• 用80～150μL冰冷的提取液D溶解步骤12中的下层部分（Ⅱ），即得膜蛋白。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  注：
  ● 建议用BCA法进行蛋白定量。
  ● 蛋白样品-80℃存放一年没问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 蛋白浓度低？
  处理部分样本时可能没有裂解完全，导致核蛋白/膜蛋白浓度低。只要适当延长试剂BC的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  膜蛋白丰度较低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大细胞的上样量。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取时出现胶状沉淀？
  核蛋白提取液处理产物中有时会出现少量透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的特定蛋白的情况下，可以直接离心取上清进行后续实验即可；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理，300w/10秒间隔10秒，超声3分钟，随后离心取上清用于后续实验。检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，不必进行超声处理。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。